METHODES |
Elles ont beaucoup progressé au cours des années récentes. Les résultats obtenus ont des répercussions extra scientifiques (politiques, sociales, écologiques), et une interprétation trop rapide est à éviter. Une critique précise de la méthodologie s'impose avant de faire des extrapolations vers la clinique humaine
Méthodes sur l'animal entier
Deux espèces servent à ces expériences : le rat et la souris. L'extrapolation à l'homme des résultats obtenus n'est pas évidente, compte tenu des différences de métabolismes intermédiaires observées entre les espèces. Les traitements cancérigènes sont débutés juste après le sevrage, voire pendant. La route d'administration mime celle éventuellement observée chez l'homme. Habituellement, la substance testée est soit le produit chimique très purifié soit le produit avec ses impuretés habituelles. Le résultat nécessite plusieurs mois d'élevage.
Chaque groupe d'animaux doit être assez fourni pour permettre une étude statistique satisfaisante (25). Deux à trois doses différentes sont utilisées, en général à 10% de la dose maximum tolérée (celle qui n'induit pas de morts immédiates). Ces doses, pour être efficaces chez l'animal, sont souvent sans rapport réel avec celles qu'éventuellement l'homme subit. On en est réduit avec des extrapolations vers le bas, aboutissant parfois à des résultats aléatoires ( pas d'interprétation simpliste).
Un protocole voisin consiste à tester l'action de produits cancérigènes sur le foie du rat, après hépatectomie partielle. Celle-ci entraîne une régénération hépatique considérable (multiplication cellulaire). L'exposition à un agent cancérigène entraîne la formation de petits foyers de nodules évoluant vers l'hépatocarcinome.
Tests in vitro
Un grand nombre de tests ont été développés pour essayer d'obtenir des résultats plus rapides et à moindre coût. Ils sont basés sur le pouvoir mutagène des produits initiateurs. L'effet observé consiste dans la recherche des lésions d'ADN (formation d'adduits, rupture des brins de DNA, réparation enzymatique), des mutations et des lésions chromatiniennes (aberrations, échange , formation de micro noyaux).
Un certain nombre de mutagènes nécessitent une métabolisation avant action. On utilise pour cela un extrait acellulaire de microsomes du foie de rat, ou fraction S9 obtenu par ultracentrifugation. On incube le produit testé sur cet extrait, avant de mettre en route le test de mutagenèse.
Un des test les plus courants est le test d'Ames. Il utilise une salmonelle typhique déficiente en enzyme de synthèse de l'histidine. En cas de mutation, les bactéries mutées récupèrent cette possibilité de synthèse. Donc, les bactéries non mutées ne poussent pas dans un milieu agar sans histidine, alors que les bactéries mutées forment des colonies, en nombre proportionnel à l'effet mutagène observé.
Quelques méthodes ont été développées pour tester cette mutagenèse dans des cellules humaines ou de mammifères. La transformation observée se traduit par une perte de l'inhibition de contact, la croissance en milieux semi liquides, des modifications morphologiques. Cependant, la technique est plus aléatoire.
Pour minimiser les risques de faux négatifs ou de faux positifs, on multiplie les types de tests. Les réponses positives doivent être considérées comme suggérant une action carcinogène, et pousser à une investigation plus complexe (sur l'animal entier). Les tests négatifs n'établissent pas la sécurité absolue des produits.
Méthodes spécifiques d'étude
Plus récemment, des méthodes de biologie moléculaire ont été mises au point pour reproduire les mutations observées et tester leur importance physiopathologique.
Ainsi, on peut effectuer in vitro des mutations sur le DNA, puis transfecter ce DNA dans la cellule entière par un plasmide qui va intégrer la mutation au niveau du DNA cellulaire (méthode du vecteur navette).
De nombreuses expériences ont utilisé la lignée cellulaire NIH/3T3 dérivée des fibroblastes embryonnaires de souris, qui, bien que normale dans son phénotype, est immortelle. Les transfections permettent de détecter des gènes promoteurs de tumeurs. Dans ce cas, la cellule perd son phénotype normal et se met à proliférer. On verra plus loin, qu’en pratique, il faut en général deux oncogènes pour pouvoir observer une transformation.
Une autre méthode, purement in vitro consiste à provoquer la mutation à l'endroit désiré et à observer l'effet obtenu sur la réplication du DNA, in vitro, par électrophorèse.
Une méthode récente utilise les souris transgéniques, sur lesquelles on a greffé un gène spécifique dont on veut étudier spécifiquement la sensibilité à un mutagène. La possibilité d'injections répétées d'un agent cancérigène utilisé à petites doses permet de mieux s'approcher de la situation clinique humaine
La meilleure connaissance des mécanismes de la carcinogenèse conduit à développer des stratégies de détection des risques de cancer chez l'homme. En particulier, l'étude des adduits dans les organes cibles ou dans les liquides biologiques permet de préciser le rôle de certains agents externes.
L'exposition relativement faible, par rapport à nos méthodes de détection, oblige à affiner des techniques souvent complexes et très coûteuses : immunomarquage, spectroscopie de fluorescence, étude de la conductance électrochimique, spectrométrie de masse, chromatographie en phase gazeuse.
Le polymorphisme du métabolisme des agents externes pose problème. Cependant, l'utilisation de substances indicatrices peut aider : ainsi, la caféine est déméthylée sous l'action du cytochrome P450. L'étude de ses métabolites (théophylline, paraxanthine, théobromine, acide 1, 3, 7 triméthyl urique) permet d'évaluer le métabolisme probable d'autres molécules comme les arylamines, retrouvées dans la fumée de cigarette. On détermine ainsi des sujets à acétylation rapide ou lente.
Une autre substance témoin est constituée par le médicament hypotenseur debrisoquine. Les sujets qui le métabolisent rapidement au niveau du cytochrome P450 ont un risque beaucoup plus grand de cancer du poumon que ceux qui le métabolisent lentement.
De nombreuses études sont en cours sur le gène H-ras, dont certains allèles permettraient de tester la susceptibilité à l'action cancérigène du tabac.
Ainsi, l'épidémiologie moléculaire ajoute un complément important à la simple notion d'exposition à un agent cancérigène, en essayant de mettre en évidence des facteurs personnels de susceptibilité à l'action de ces toxiques. Elle cherche à comprendre la variabilité individuelle dans la biodistribution des carcinogènes, dans leur métabolisme, dans leur pouvoir de former des adduits, dans les mécanismes de réparation du DNA.
Ces études permettront une prévention plus personnalisée et peut-être ainsi plus efficace.
Tabac